献血者EBV、HHV?6和HHV?7 DNA检测对输血意义

                      作者：杨永洁 尼宏莉 李欣 王笑峰 王云 于琦 罗兵

【摘要】  目的 了解青岛地区献血者单个核细胞（PBMC）和唾液标本中EB病毒(EBV)、人疱疹病毒6型(HHV?6)和人疱疹病毒7型(HHV?7)的感染情况。方法 采用PCR?Southern blotting检测109名健康无偿献血者外周血PBMC和唾液标本中EBV DNA，巢式 PCR技术检测HHV?6和HHV?7 DNA，限制性酶切分析分别对HHV?6、HHV?7进行分型和鉴定。结果 109名献血者外周血PBMC中EBV DNA检出率为21.10%(23/109)，HHV?6 DNA检出率为50.46%(55/109)，HHV?7 DNA检出率为57.80%(63/109)。唾液标本中EBV、HHV?6和HHV?7 DNA检出率分别为24.77%(27/109)、 66.06%(72/109)和90.83%(99/109)。PBMC中EBV、HHV?6和HHV?7均阳性者7例，占6.4%；唾液标本中均阳性者17例，占15.6％。酶切分析结果显示，55例献血者外周血PBMC HHV?6阳性标本中HHV?6A型占18.2%(10/55)，HHV?6B型占81.8%(45/55)；72例唾液HHV?6阳性标本中HHV?6A型占16.7%(12/72)，HHV?6B型为83.3%(60/72)。结论 外周血PBMC和口咽部上皮细胞是EBV、HHV?6和HHV?7潜伏的重要部位，献血员中存在上述病毒的共感染。 
【关键词】  疱疹病毒4型,人；疱疹病毒6型，人；疱疹病毒7型，人；输血
　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the prevalence of EBV,HHV?6 和 HHV?7 in peripheral blood mononuclear cel1s (PBMC) and saliva samples in blood donor. Methods PCR?Southern blotting was adopted to detect EBV DNA in PMBC and saliva of 109 blood donors in Qingdao; nested?PCR method to detect HHV?6 and HHV?7 DNA; restriction map to type and identify HHV?6 and HHV?7.  Results Of the 109 blood donors, the detection rates of EBV DNA, HHV?6 DNA and HHV?7 DNA in PMBC were 21.10% (23/109), 50.46% (55/109) and 57.80% (63/109), respectively; in saliva, the rates were  24.77% (27/109),66.06% (72/109) and 90.83% (99/109), respectively.  In PBMC, seven cases were with all the three items, EBV,HHV?6 and HHV?7, were positive, accounting for   6.4% (7/109); in saliva, the positive case was 17, accounting for  15.6％ (17/109). Restriction enzyme analysis revealed that 18.2% (10/55) of HHV?6A in PBMC and 16.7% (12/72) in saliva, 81.8%(45/55) of HHV?6B in PBMC and 83.3%(60/72) in saliva. Conclusion Peripheral blood mononuclear cel1s and epithelial cells of pharynx oralis are the important latent sites for EBV,HHV?6 and HHV?7. Co?infection of EBV with HHV?6 and HHV?7 exists in blood donors.
    
　　［KEY WORDS］ herpesvirus 4, human; herpesvirus 6, human; herpesvirus 7, human; blood transfusion
    
　　输血治疗是临床医学的重要手段之一，但输血并不是有益无害的治疗手段，也不是绝对安全的[1]。输血所致病毒感染一直为国内外输血界所关注，因此，与输血相关的病毒感染的危险性及检测病毒基因组的价值已成为医学领域中一个研究热点[2]。EB病毒（EBV）、人疱疹病毒6型（HHV?6）和7型（HHV?7）同属于人疱疹病毒科，原发感染后在宿主体内长期潜伏，可因输血或某些症状性疾病而激活，增加其再活动的危险度。大部分健康成人感染并携带EBV、HHV?6和HHV?7，病毒可持续存在于外周血细胞和唾液腺细胞中，而且唾液中可分泌具有感染性的病毒颗粒，对人体产生持久而稳定的感染。本研究采用PCR?Southern blotting检测109名健康无偿献血者外周血单个核细胞(PBMC)和唾液标本中EBV DNA，巢式 PCR(nested?PCR)技术结合限制性酶切分析检测其HHV?6和HHV?7 DNA，以调查献血员EBV、HHV?6和HHV?7的感染状况，分析其是否存在共感染及对输血的意义。
　　1  材料与方法
　　1.1  样本来源
    
　　随机采集青岛地区109名无偿献血者外周静脉血 10 mL (枸橼酸钠抗凝，比例1∶9)和唾液5 mL。109名献血者丙氨酸转氨酶（ALT）≤25 U(赖氏法)，HBsAg、抗?HCV、抗?HIV和梅毒螺旋体抗体均阴性，其他项目也均符合国家规定献血标准。
　　1.2  标本DNA的提取
    
　　枸橼酸钠抗凝血分离PBMC，唾液标本离心取沉淀，分别加入2 mL裂解缓冲液（含10 mmol/L Tris?HCl，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，100 mg/L 蛋白酶K，1 g/L SDS），55 ℃消化2 h。采用酚?氯仿?异戊醇法常规提取细胞DNA，干燥后以TE缓冲液（pH 8.0）溶解，4 ℃保存备用。
　　1.3  EBV、HHV?6和HHV?7 DNA的检测
    
　　EBV特异性引物和探针参照文献[3]设计，上游引物序列为5′?CCAGACAGCAGCCAATTGTC?3′，下游引物序列为5′?GGTAGAAGACCCCCTCT?TAC?3′，探针序列为5′?CCCTGGTATAAAGTGGTCCTGCAGCTATTTCTGGTCGCATC?3′，扩增产物的长度为129 bp。PCR扩增的反应体系及Sou?thern boltting检测EBV DNA均参考文献[3]方法进行。巢式PCR扩增HHV?6 和HHV?7 DNA内外侧引物的设计和扩增条件分别参考文献[4?5]进行，HHV?6外侧扩增产物长度为287 bp，内侧扩增产物长度为163 bp；HHV?7外侧扩增产物长度为186 bp，内侧扩增产物长度为124 bp。
　　1.4  HHV?6限制性酶切分型和HHV?7鉴定
    
　　HHV?6酶切反应的体积为20 μL，包括10×buffer 2 μL，PCR扩增产物10 μL，限制性核酸内切酶Hind Ⅲ 10 U，去离子水补充体积至20 μL，混匀后瞬时离心，37 ℃水浴12～16 h。取酶切产物10 μL于120 g/L聚丙烯酰胺凝胶中80 V垂直电泳1 h，凝胶用EtBr （0.5 mg/L）染色20 min，紫外线透射仪下观察并记录电泳结果。HHV?6A可观察到66 bp和97 bp的条带，而HHV?6B未被消化，为163 bp的扩增条带。HHV?7 PCR扩增产物采用限制性核酸内切酶EcoRⅠ进行酶切鉴定，反应条件和电泳条件同上，HHV?7特异性PCR扩增产物可观察到45 bp和79 bp的两条带。